癌症患者90%以上的死亡率与耐药性有关？耐药性的持续存在仍然是该领域的一大挑战,这也是癌症死亡率高的原因？肿瘤细胞的耐药怎么样？ 怎么构建肿瘤细胞的耐药？以下几种方法轻松搞定耐药株的构建：

肿瘤耐药株的构建方法主要有以下几种：

一、药物浓度递增法

药物浓度递增法是指最初使用低浓度的药物刺激细胞，等待细胞适应低浓度的环境之后，再略微提高药物浓度，继续等待细胞适应，经过反复的培养和加压，最终使细胞可以在高浓度的药物环境下生存。

二、大剂量药物冲击法

大剂量药物冲击法是在细胞培养时加入超高浓度的药物，但孵育时间很短，一般仅有几分钟，然后将细胞转移至不含药物的培养液中慢慢恢复，通过重复以上步骤最终筛选出高倍数的耐药细胞株。

三、药物浓度递增与大剂量药物冲击相结合法

这种方法结合了上述两种方法的优点，既通过药物浓度递增使细胞逐渐适应高浓度药物环境，又通过大剂量药物冲击模拟临床上的化疗方式，以筛选出更具稳定性和耐药性的细胞株。但这种方法相对复杂，操作难度较高。

四、转基因结合药物筛选法

转基因结合药物筛选法是通过基因工程技术将耐药相关基因导入细胞，然后通过药物筛选获得耐药细胞株。

开始构建肿瘤细胞的耐药株啦

一、选取状态良好的肿瘤细胞作为亲本细胞，进行扩增培养。

二、通过MTT或者CCK8实验，确定亲本细胞对目标药物的初始敏感性，即IC50（半数抑制浓度）值。

耐药株IC50的计算可以采用以下两种方法：

1. 改良寇式法：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中，Xm为lg最大剂量，I为lg(最大剂量/相临剂量)，P为阳性反应率之和，Pm为最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率。

也可以通过实验测定不同浓度药物对耐药株的生长抑制率，然后绘制生长抑制率与药物浓度的关系曲线，通过曲线找到抑制率为50%时对应的药物浓度，即为IC50。耐药指数（RI）也是一个相关指标，可以通过耐药组IC50与亲代细胞IC50的比值来计算，即RI=耐药组IC50/亲代细胞IC50。

需要注意的是：IC50的计算可能受到多种因素的影响，如实验条件、细胞状态、药物纯度等，因此在实际操作中需要严格控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。

三、条条大路通罗马，几条路走下来发现这种方法构建稳转的耐药株最快，而且稳

1. 使用最低有效剂量的药物持续刺激亲本肿瘤细胞一段时间（如48小时），让细胞适应这一药物环境。

2. 然后，更换不含药物的培养基继续培养传1-2代（以细胞生长倍增正常为准），传代待细胞生长至80%左右，再次使用高于细胞耐受的浓度的药物培养5-10分钟后换液，去除死细胞，PBS清洗两次，加含有2X最低剂量的培养基培养至细胞长满，传代；之后每次传代后在细胞长到80%以上的密度用高浓度药物培养基冲击一次，再换上比之前代次高一倍的培养基培养直到耐药指数达到细胞耐药的顶峰。

四、耐药细胞株的筛选与验证

在高浓度药物诱导下，筛选出生长状态良好的细胞，进一步扩增培养。

通过耐药倍数检测、耐药相关蛋白检测等方法，验证耐药细胞株的耐药性；验证方法参考步骤二。

五、耐药细胞株的稳定与维持

将筛选出的耐药细胞株脱药培养3代后开始冻存，以确保其稳定性。

定期检查细胞的生长情况和耐药性，如有必要，可进一步进行筛选和优化。

                                                      T24/DDP 人膀胱癌耐药细胞

                                               检测的实验结果

六、需要注意的小细节

1. 在整个过程中，需确保实验操作的无菌性，避免细胞污染。

2. 药物浓度的刺激和递增应循序渐进，避免细胞因药物浓度过高而死亡。

3. 耐药细胞株的构建和培养都可能需要长时间和大量的努力，而且不同的细胞对耐药的展现的形态也不一样，比如T24/DDP此细胞耐药值在1ug/ml，但是在药物加到800ng/ml的时候细胞就会和药物发生抵抗：它会长触角并且伴有分泌物产生，当药物加到1ug/ml的时候耐药细胞会比正常细胞生长周期缓2-3天左右；和抗揍的HepG2相比，它的耐药是很多肿瘤细胞都望尘莫及的，它的IC50值可达23.35 μg/mL，药物浓度越高，细胞发生的簇集反应越大以对抗药物。