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细胞内抗原染色——直接标记

作者:上海岚兴生物科技有限公司 2016-11-17T00:00 (访问量:2125)

 细胞内抗原染色——直接标记

A. 所需溶液和试剂

1. 磷酸盐缓冲液 (C01-01002):0.1M PH7.4 1X PBS

2. 固定液:4%多聚甲醛溶液(无甲醇)(C01-06001);1%多聚甲醛溶液(无 甲醇)(C03-02001) 3. 穿膜剂(C01-03001):0.3% tritonX-100

4. 抗体封闭液(C03-03001):10%山羊血清溶液

5. 孵育缓冲液(C03-03002):2% BSA 的 0.1M PBS

6. 抗体稀释液(C01-04001):1% BSA, 0.03% Proclin300 的 0.1M PBS

B. 样本处理——固定穿膜

1. 离心收集细胞,弃上清。

2. 将细胞重悬在 1 ml PBS(C01-01002)中。加入等体积甲醛溶液(C01-06001) 至终浓度为 2%,37°C 固定 10 分钟。(或者用 70%的冰乙醇 5-10ML ,4℃ 固定 16 小时)

3. 放在冰上降温 1 分钟后加入 1 X PBS ,800rpm 离心 5min 去上清,重复一 次。

4. 细胞浆内抗体用 0.3% tritonX-100(C01-03001) 穿膜 5 分钟(若细胞核内的 抗体标记,用 90%的冰甲醇穿膜 30 分钟)。

C. 抗体标记

1. 将 0.5-1 x 106 个细胞分到各检测管中(依照体积)。

2. 各管加入 2 ml PBS(C01-01002),200g 离心 5 分钟, 回收细胞;重复一次。

3. 向每支检测管中加入 100μl 孵育缓冲液 (C03-03002)重悬细胞。

4. 再向每支样品管中加入 100μl 10%山羊血清的孵育缓冲液(C03-03001), 室温,封闭 15 分钟。

5. 向每支样品管中加入经抗体稀释液(C01-04001)按合适比例稀释后的荧光 一抗,室温孵育 30 分钟。

6. 加入 2 ml 孵育缓冲液,200g 离心 5 分钟,离心回收细胞;重复一次。

7. 将细胞重悬在 1%多聚甲醛溶液(C03-02001)中然后用流式细胞仪检测。

注意:

1.甲醛溶液加入量为 1X106 cells / m L。

2.冰乙醇与冰甲醇的加入方法: 向细胞中逐滴加入冰乙醇;向细胞中缓慢加入冰甲醇。

3.同型对照的设置。

4.标记前细胞计数。

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