一、实验材料
1. DNA样本：大肠杆菌菌落、大肠杆菌菌液、农杆菌菌落、酵母菌落、小鼠基因组DNA、玉米基因组DNA、水稻基因组DNA。
2.快速PCR试剂：N132001，2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye)
3. 其他试剂：RNase-free H2O或DEPC处理水、相关基因上下游引物(储存浓度10 μM)。
4. 设备与耗材：移液器、PCR仪、冰盒、离心机、EP管、RNase-free离心管。
二、实验步骤
1. 试剂&样本前期准备
1）试剂解冻和混匀：
冰箱取出：从-20℃冰箱中取出含酶试剂，立即放入冰盒中（冰上操作）。避免将试剂直接放在室温下解冻，以免温度波动影响酶的活性。
缓慢解冻：让试剂在冰上自然解冻，通常需要5-10分钟。如果需要快速解冻，可以将试剂握在手中轻轻摇晃，但不要过度加热。
低速离心：PCR Mix在1×预混液中含有2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs，使用前要充分解冻混匀。将试剂管短暂离心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管盖上的液体集中到管底。离心后置于涡旋仪震荡10 sec混匀，确保试剂均匀分布。混匀后的试剂应继续放在冰上，避免长时间暴露在室温下。如溶解后，暂未使用，可暂时储存于4度放置。
Tips：混匀时尽量避免产生气泡，气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。
2）模板稀释（若需要）
以下是针对不同模板，PCR反应时推荐的使用量，用无菌超纯水稀释DNA或者线性化载体至目标浓度。Tips：模板DNA在储存的过程中会有一定程度的降解，储存前测试的浓度不一定准确，为了保证实验精度，在放置一段时间后，需重新测试DNA模板浓度。
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模板种类 |
使用量范围（25 μL反应体系） |
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基因组DNA |
10–1,000 ng |
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质粒或λDNA |
0.5-50 ng |
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大肠杆菌菌液 |
0.5-0.8 OD600（2-4 μL） |
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大肠杆菌、农杆菌菌落 |
挑菌 |
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酵母菌菌落 |
挑菌到50 μL水中煮沸，冷冻，再溶解后取1-2 μL上样 |
3）上机扩增，对比不同品牌扩增不同模板的性能
表 不同模板取样原则
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模板 |
取样原则 |
备注 |
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以大肠杆菌菌落、农杆菌菌落为模板 |
尽量使用新鲜长满的平板
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大肠杆菌、农杆菌平板4度存放不得超过45天 |
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以大肠杆菌菌液为模板 |
使用新鲜摇菌的大肠杆菌菌液。挑取单菌落至1 mL液体培养基中，37℃摇床180 rpm培养3-4 h，至菌液浑浊但偏澄清的状态，使用分光光度计测试OD600下的菌液浓度，OD600=0.5-0.6最佳。 |
OD600不宜超过1.2，菌液太浓会抑制扩增。 |
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以小鼠、玉米、水稻基因组DNA为模板 |
预计添加的样本量为100 ng，将基因组DNA均稀释为50 ng/μL |
根据Arcegen N132001说明书中基因组添加量进行样本稀释 |
表 PCR反应体系
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组分 |
体系 |
终浓度 |
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Arcegen，2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye)/V*/N*/P*/T* |
12.5 μL |
1× |
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上游引物F |
1 μL |
0.4-0.5 μM |
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下游引物R |
1 μL |
0.4-0.5 μM |
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大肠杆菌菌落/农杆菌菌落/大肠杆菌菌液/基因组DNA（50 ng/μL） |
挑菌/挑菌/2 μL/2 μL |
- |
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RNase-free H2O |
Up to 25 μL |
- |
【注意】配制完成后，用桌面离心机瞬离所有试剂到管底，然后涡旋10 sec振荡混匀，若期间有气泡，要将气泡轻轻指弹震裂，离心10 sec后立即上机；若暂时不能上机，可于-20℃暂存1 h。
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表 Arcegen产品PCR反应程序 |
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
95℃ |
3 min |
1 |
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95℃ |
15 sec |
35 |
|
60℃ |
20 sec |
|
|
72℃ |
1 sec/kb |
|
|
72℃ |
5 min |
1 |
|
4℃ |
∞ |
1 |
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表 P产品PCR反应程序-按P品牌说明书 |
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表 N产品PCR反应程序-按N品牌说明书 |
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
95℃ |
2 min |
1 |
95℃ |
30 sec |
1 |
|
|
95℃ |
30 sec |
35 |
95℃ |
15 sec |
30 |
|
|
60℃ |
15 sec |
60℃ |
15 sec |
|||
|
72℃ |
15 sec /kb |
68℃ |
1 min/kb |
|||
|
72℃ |
5 min |
1 |
68℃ |
5 min |
1 |
|
|
4℃ |
∞ |
1 |
4℃ |
∞ |
1 |
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表 V产品PCR反应程序-按V品牌说明书 |
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表 T产品PCR反应程序-按T品牌说明书 |
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
95℃ |
3 min |
1 |
95℃ |
3 min |
1 |
|
|
95℃ |
15 sec |
35 |
95℃ |
30 sec |
35 |
|
|
60℃ |
15 sec |
60℃ |
30 sec |
|||
|
72℃ |
15 sec/kb |
72℃ |
1 min/kb |
|||
|
72℃ |
5 min |
1 |
72℃ |
5 min |
1 |
|
|
4℃ |
∞ |
1 |
4℃ |
∞ |
1 |
|
【注意】
A.推荐退火温度：60°C，也可根据自身需要设立温度梯度摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20 sec，可以在10-30 sec内调节。但需注意退火时间过长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
B.延伸速度设置可参考下表：本次扩增目的片段均为1 kb左右，因此设置为1 sec/kb。
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模板类型 |
片段大小 |
扩增速度 |
备注 |
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简单模板（质粒、λDNA等） |
≤6 kb |
1 sec/kb |
如需提高产量可适当延长延伸时间，不宜超过30 sec/kb。 |
|
6-10 kb |
3 sec/kb |
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|
＞10 kb |
5-10 sec/kb |
||
|
复杂模板（基因组、大肠杆菌等） |
≤3 kb |
1 sec/kb |
|
|
3-6 kb |
3 sec/kb |
||
|
6-10 kb |
5-10 sec/kb |
||
|
＞10 kb |
10 sec/kb |
C.循环数可设置为30-35个循环。无需再增加循环数。因为过多的循环虽然能增加产物量，但会导致非特异性产物扩增和假阳性的风险。
4）产物电泳
配制1%琼脂糖凝胶插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反应液上样（Arcegen PCR试剂已含有红色示踪染料，无需添加loading buffer，可直接上样）。
A、Arcegen产品扩增不同模板表现优于市面上其他竞品，扩增速度快，检出率高，扩增产量高。
注：1：大肠杆菌菌落；2：大肠杆菌菌液；3：小鼠基因组DNA；4：玉米基因组DNA；5：水稻基因组DNA；6：农杆菌菌落。
B、Arcegen产品扩增酵母表现优于市面上其他竞品，扩增速度快，检出率高，扩增产量高。
产品订购
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产品应用 |
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
目录价 |
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广泛物种及样本快速PCR，菌落及菌液PCR，阳性克隆快速鉴定 |
N132001E |
1 mL |
60.00 |
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N132001S |
5×1 mL |
250.00 |
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|
N132001M |
50×1 mL |
2000.00 |
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|
N132001L |
100×1mL |
3500.00 |
相关产品
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应用类型 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
目录价 |
|
50℃快至5分钟完成重组反应，阳性率可达95%以上 |
N132081S |
20 T |
500.00 |
|
|
N132081M |
50 T |
1100.00 |
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|
凝胶电泳必备款 |
N132101S |
100 g |
180.00 |
|
|
N132101M |
500 g |
810.00 |
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|
无需称量，一次一片，不用担心琼脂糖挂壁 |
N132103S |
1 BOX (200 TABLETS) |
1200.00 |
|
|
替代EB的无毒染料，适用蓝光及紫外光 |
N132109S |
500 μL |
580.00 |
|
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N132116S |
100 T |
110.00 |
|
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N132116M |
10×100 T |
990.00 |
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|
N132111S |
100 T |
110.00 |
||
|
N1321112M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132112S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132112M |
10× 100 T |
990.00 |
||
|
N132113S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132113M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132114S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132114M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132115S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132115M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132117S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132117M |
10× 100 T |
990.00 |
||
|
N132118S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132118M |
10× 100 T |
990.00 |
||
|
N132119S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132119M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132120S |
1 mL |
110.00 |
||
|
N132120M |
100x1 mL |
20900.00 |
||
|
N132121S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132121M |
10× 100 T |
990.00 |