马外周血白细胞分离液试剂盒

操作步骤：

1. 取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液。

2. 在离心管中加入适量分离液（血液体积小于5mL时，加入5mL分离液；大于等于5mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）

3. 室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。

4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层；血浆与分离液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。

5. 小心的吸取淋巴细胞层及分离液层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心10min（如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）

6. 弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

7. 重复步骤6

8. 弃上清，细胞重悬备用。

注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2 h以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。

D. 血液样本不需稀释，直接进行分离即可。

E. 稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。

分离示意图

F. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

G. 血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件。

H. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。

I. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

参考文献：

1. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab InvestSuppl. 1968; 97: 7.

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5. Recalde HR. A simple method of obtaining monocytes in suspension. J Immunol Methods. 1984 Apr13;69(1):71-7.

6. BøyumA,LøvhaugD,TreslandL.Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand J Immunol. 1991 Dec; 34(6):697-712.

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